EXTRAIT

Contexte : À ce jour, tous les cas de lipodystrophie partielle familiale de type 2 (FPLD2, MIM 151660) résultent de mutations faux-sens dans LMNA, qui code pour la lamine nucléaire A/C (MIM 150330).

Objectif : Réaliser une analyse mutationnelle de LMNA chez deux sœurs présentant un phénotype FPLD2 particulièrement sévère.

Conception : Rapport de cas descriptif avec études moléculaires.

Paramètre : Centre de référence.

Patients : Nous rapportons deux sœurs d'origine sud-asiatique. Le premier a présenté une acanthosis nigricans à l'âge de 5 ans, un diabète avec résistance à l'insuline, une hypertension et une hypertriglycéridémie à l'âge de 13 ans et une lipodystrophie partielle débutant à la puberté. Sa sœur et leur mère avaient un profil métabolique et des caractéristiques physiques similaires, et leur mère est décédée d'une maladie vasculaire à l'âge de 32 ans.

Interventions : Aucune.

Principaux critères de jugement et résultats : le séquençage LMNA a montré que les sœurs étaient chacune hétérozygotes pour une nouvelle mutation G>C au niveau du site donneur d'épissage consensuel de l'intron 8, qui était absent des génomes de 300 individus sains. La rétention de l'intron 8 dans l'ARNm a prédit une isoforme de lamin A prématurément tronquée (516 au lieu de 664 acides aminés) avec 20 résidus 3'-terminaux non-sens. L'isoforme mutante de la lamine A n'a pas pu interagir normalement avec l'émerine et n'a pas réussi à se localiser dans l'enveloppe nucléaire.

Conclusions : Il s'agit de la première mutation d'épissage LMNA à être associée à FPLD2, et elle provoque un phénotype clinique et métabolique sévère.


Les lipodystrophies sont caractérisées par une perte de graisse dans des sites anatomiques spécifiques (1,2). Il existe deux types de lipodystrophie partielle familiale (FPLD) de type Dunnigan : FPLD2 (MIM 151660) résulte de mutations hétérozygotes dans LMNA (MIM 150330), codant pour la lamine nucléaire A/C, tandis que FPLD3 (MIM 604367) résulte de mutations hétérozygotes dans PPARG. (MIM 601487), codant pour le récepteur activé par les proliférateurs peroxysomaux (PPAR)γ (2). FPLD2 est une laminopathie et est l'un des 16 phénotypes de maladie distincts qui résultent de plus de 100 mutations LMNA différentes, dont 12 phénotypes autosomiques dominants (AD) et quatre autosomiques récessifs (AR) (3). La position de mutation dans la séquence d'ADN génomique primaire de LMNA est associée à la pathologie des tissus et des organes (3). A ce jour, plus de 90% des mutations LMNA sont des mutations faux-sens (3). Toutes les mutations signalées dans FPLD2 sont des mutations faux-sens LMNA, se produisant généralement dans la moitié 3' de la protéine (3). Quelques mutations non-sens hétérozygotes sont à l'origine de certains cas de cardiomyopathie dilatée (3) et de dystrophie musculaire d'Emery-Dreifuss (3). Des mutations hétérozygotes d'épissage LMNA ont été rapportées dans certains cas de progeria (4), de dermopathie restrictive (5) et de dystrophie musculaire des ceintures (6). Nous rapportons les premiers individus atteints de FPLD2 qui sont hétérozygotes pour une nouvelle mutation LMNA qui affecte l'épissage de l'ARN et qui ont initialement présenté des caractéristiques cliniques et métaboliques étonnamment graves de FPLD2.

SUJETS ET METHODES

Sujets d'étude

Sujet 1. La patiente index, une femme d'ascendance sud-asiatique, a été référée à la clinique de génétique médicale à l'âge de 20 ans. Ses antécédents médicaux ont révélé la présence d'acanthosis nigricans à partir de l'âge de 5 ans. L'hypertension, l'hypertriglycéridémie et l'hyperinsulinémie ont été diagnostiquées à l'âge de 13 ans. et elle a développé un diabète de type 2 (T2DM) peu de temps après. À 13 ans, un hirsutisme facial et corporel important, un habitus masculin et une acné modérément sévère ont été notés, et une hidrosadénite suppurée a été diagnostiquée après l'ablation de kystes des régions pubiennes et axillaires. Elle a eu ses premières règles à 9 ans, avec une aménorrhée secondaire depuis l'âge de 10 ans. À 10 ans, on lui a diagnostiqué une dépression. Une échographie rénale à 13 ans et un scanner crânien à 14 ans étaient normaux. À 14 ans, un électrocardiogramme (ECG) montrait un allongement de l'intervalle QT avec des anomalies diffuses de repolarisation, alors qu'un échocardiogramme était normal. Une pancréatite aiguë secondaire à une hypertriglycéridémie a entraîné une hospitalisation à l'âge de 17 ans, date à laquelle aucune hépatomégalie n'a été observée au scanner abdominal. À 21 ans, elle s'est fait retirer un polype des cordes vocales; un électrocardiogramme a révélé un rythme sinusal normal et une étude de perfusion myocardique persantine était normale.
Lors d'un examen physique à 20 ans, on a noté qu'elle avait un visage rond et une voix profonde et rauque. Elle avait une acanthosis nigricans généralisée, des étiquettes cutanées et des kystes dans les régions axillaires et pubiennes, une lipodystrophie sévère avec pseudohypertrophie des muscles et des grandes lèvres, des veines proéminentes, une absence de graisse fessière, un hirsutisme et un habitus cushingoïde, mais sans manifestations cataboliques ou somatiques.


Sujet 2. La sœur du proposant 1 a été évaluée pour la première fois à la clinique de génétique médicale à l'âge de 26 ans. Elle a reçu un diagnostic de DT2, d'hypertriglycéridémie et d'hypertension à l'âge de 17 ans. À 18 ans, on a noté qu'elle présentait de nombreuses lésions cutanées, notamment des plaques hypertrophiques papillomateuses veloutées brun clair sur la nuque et les côtés du cou, les aisselles et l'aine, une hyperkératose verruqueuse des régions de flexion des coudes, du dos des mains et des chevilles et nombreuses étiquettes de peau sur le cou et les aisselles. A 19 ans, elle est hospitalisée pour une pancréatite aiguë, secondaire à une hypertriglycéridémie, compliquée d'un pseudokyste nécessitant une pancréatectomie subtotale. Un scanner abdominal a montré une stéatose hépatique diffuse et une hépatomégalie. Au début du traitement à l'insuline, les changements dermatologiques ont régressé, ne laissant que des acanthosis nigricans légers. Les règles étaient normales. Des paralysies bilatérales du sixième nerf crânien sont survenues à deux reprises. Elle a également reçu un diagnostic de dépression pendant son adolescence. À 24 ans, elle a noté une faiblesse des membres inférieurs avec une endurance réduite. Une évaluation neurologique a démontré une faiblesse musculaire proximale des membres supérieurs et inférieurs, une diminution de la sensation de température et de douleur des membres inférieurs et une diminution des réflexes tendineux profonds. Une étude d'électromyogramme (EMG) a révélé des anomalies non spécifiques compatibles avec un processus myopathique. La créatine kinase sérique n'était pas élevée.
À l'examen physique à 26 ans, on a noté qu'elle avait un visage rond, une légère acanthosis nigricans de la nucale, des étiquettes cutanées, une lipodystrophie sévère avec pseudohypertrophie musculaire, des veines saillantes, une absence de graisse fessière et un hirsutisme.

Le phénotype de lipodystrophie était moins sévère que celui du sujet 1. Comme sa sœur, elle a signalé un appétit vorace et une intolérance à la chaleur.


Mère des proposants. L'histoire de la mère des proposants a été obtenue à partir des dossiers médicaux. À 23 ans, une fibrillation auriculaire a été diagnostiquée et traitée avec de la digoxine. Elle n'a pas reçu de traitement anticoagulant. À 25 ans, elle s'est plainte de douleurs abdominales récurrentes et a reçu un diagnostic de « tachycardie paroxystique ». Une hépatomégalie et une élévation des transaminases sériques ont été rapportées à plusieurs reprises. Des investigations à 27 ans pour suspicion d'atrophie musculaire ont révélé un examen neurologique, un EMG et une concentration sérique de créatine kinase normaux. Une biopsie musculaire a montré de petites fibres de type 1 et une augmentation du tissu conjonctif, compatible avec un syndrome de disproportion bénigne de type fibre. Le DT2 a été diagnostiqué à l'âge de 28 ans, mais le résultat du profil lipidique n'était pas disponible. Elle avait une acné sévère persistante. À 28 ans, elle présente une hémiparésie droite causée par un accident vasculaire cérébral gauche d'origine cardiogénique. L'échocardiographie a révélé une valve aortique bicuspide, une sténose mitrale et une cardiomyopathie qui a été considérée comme secondaire à une maladie valvulaire. L'anticoagulation a été commencée et un stimulateur cardiaque a été placé l'année suivante. L'observance de la médication était irrégulière. À 32 ans, elle a présenté un infarctus massif de l'hémisphère droit. À l'époque, elle était hypertendue et présentait de multiples lésions papulo-pustuleuses sur le dos, la poitrine et les extrémités, un hirsutisme et une atrophie importante des muscles des extrémités avec préservation de la musculature de la ceinture. Elle est décédée d'une insuffisance respiratoire peu de temps après.


L'examen des photographies d'enfance des sœurs et de leur mère a suggéré qu'elles avaient une distribution normale des graisses dans l'enfance, la lipodystrophie commençant au début de la puberté.

Autre histoire familiale. Les parents non consanguins des proposants étaient d'origine punjabi. Une tante maternelle avait un problème cardiaque mais pas de diabète ni de lipodystrophie. Un oncle maternel souffrait de DT2 depuis l'âge de 60 ans et son fils souffrait de diabète depuis l'âge de 3 ans. Le grand-père maternel souffrait d'hypertension de longue date. Le père des filles souffrait d'hypertension et deux tantes paternelles et la grand-mère paternelle souffraient de diabète.


Mesures anthropométriques
La taille et le poids corporel ont été mesurés par des procédures standard. Pli cutané
l'épaisseur a été mesurée avec un pied à coulisse Lange (Cambridge Scientific Industries, Cambridge, MD) à cinq sites du tronc (poitrine, mi-axillaire, abdomen, sous-scapulaire et supra-iliaque) et quatre sites périphériques (biceps, triceps, mi-cuisse et mollet) sur le côté droit du corps. La moyenne de trois mesures répétées à chaque site a été calculée. Les circonférences ont également été obtenues pour la poitrine, la taille, la hanche, le milieu du bras, la mi-cuisse et le mollet. Les résultats des mesures de l'épaisseur et de la circonférence du pli cutané ont été comparés aux valeurs de référence de la population américaine pour le même groupe d'âge et de sexe, en centile (7). Le pourcentage de graisse corporelle totale a été déterminé par analyse d'impédance bioélectrique (BIA) dans des conditions de jeûne, comme décrit (8), et à partir de la somme des épaisseurs de plis cutanés mesurées sur quatre sites (9). La masse musculaire squelettique a été estimée à partir du BIA (10).


Analyse de l'ADN génomique
L'étude a été approuvée par le comité d'éthique de l'Université Western Ontario (protocole #07920E). Les deux patients ont donné leur consentement éclairé pour participer aux études et pour la publication de leurs informations génétiques cliniques, biochimiques et moléculaires. Les régions codantes et les limites intron-exon du gène LMNA ont été amplifiées, purifiées et la séquence d'ADN génomique a été lue sur un séquenceur d'ADN automatisé 3730 (PE-Applied Biosystems, Mississauga, ON) en utilisant des protocoles établis (11). Le dépistage de la mutation a employé le séquençage direct de l'exon 8 ; L'ADN génomique de 150 personnes en bonne santé, chacune d'origine caucasienne et sud-asiatique, a été examiné.


Analyse de l'expression génique
L'ARN total a été isolé du sang total du patient à l'aide du PAXgene
kit d'ARN sanguin (Qiagen, Mississauga, ON). L'ADNc du premier brin a été synthétisé à partir d'ARN total avec une amorce oligodT (Superscript First-strand Synthesis System, Invitrogen, Burlington, ON). Deux μl du premier brin ont été amplifiés dans un volume total de 30 μl contenant des amorces LMNA spécifiques : 5'-GGC AGT CTG CTG AGA GGA AC et 5'-GAC ACT GGA GGC AGA AGA GC, qui s'étendent de l'exon 5 à l'exon 11, y compris l'ADNc de LMNA. Trente cycles d'amplification ont été réalisés à une température de recuit de 60°C. Les produits de PCR ont été purifiés sur gel (kit d'extraction de gel QIAquick, Qiagen, Mississauga, ON) et directement séquencé sur un séquenceur d'ADN automatisé ABI 3730 (PE-Applied Biosystems, Mississauga, ON).

Constructions de vecteurs recombinants
Un fragment de 2,1 kb contenant l'ADNc complet du LMNA humain a été obtenu
par amplification en utilisant les paires d'amorces : 5'-TCC GAG CAG TCT CTG TCC TT et 5' CTG GCA GGT GGC AGA TTA CAT et premier brin d'ADNc de patients comme matrice. Le produit a été ligaturé dans le vecteur TA Cloning 2.1 (Invitrogen, Burlington, ON). L'insert a été sous-cloné dans le vecteur pcDNA3.1/myc-His (Invitrogen, Burlington, ON) après digestion par EcoRI. Pour la microscopie par immunofluorescence, le produit amplifié de l'ADNc de LMNA a été sous-cloné dans le vecteur pcDNA3.1/His avec une étiquette N-terminale codant pour l'épitope Xpress (Invitrogen, Burlington, ON) après digestion par EcoRI à l'aide d'amorces : 5'-CGG AAT TCA TGG AGA CCC CGT CCC AG et 5'-CGG AAT TCT TAC ATG ATG CTG CAG TTC TG. La fidélité de l'amplification de l'ADN et l'insertion satisfaisante des ADNc contrôle et mutant respectifs ont été confirmées par séquençage de l'ADN.
Test de transfection transitoire de culture cellulaire

Des cellules HepG2 humaines ont été cultivées dans un milieu essentiel alpha-minimum
(MEM) additionné de 100 U/ml de pénicilline, 100 μg/ml de streptomycine et 10 % [v/v] de sérum de veau fœtal inactivé chauffé (Invitrogen, Burlington, ON). Les cellules COS-7 ont été maintenues dans du MEM de Dulbecco (DMEM) contenant 10 % de sérum de veau fœtal, 100 U/ml de pénicilline et 100 μg/ml de streptomycine. Les cellules ont été ensemencées en culture plaques pour atteindre> 90% de confluence et ont été transfectées, respectivement, avec des constructions LMNA normales et mutantes et un vecteur de contrôle vide en utilisant le réactif Lipofectamine 2000 conformément aux instructions du fabricant (Invitrogen, Burlington, ON). Les cellules ont été extraites après l'ajout d'un réactif d'extraction de protéines de mammifères (Pierce, Rockford IL) 48 h après la transfection et des lysats cellulaires pré-clarifiés ont été utilisés pour une analyse Western blot ultérieure.

Électrophorèse sur gel et immunotransfert
Les lysats cellulaires ont été dilués dans un tampon d'échantillon SDS-PAGE et résolus sur
10 % SDS-PAGE (gel pré-coulé Novex, Invitrogen, Burlington, ON). Les protéines ont été transférées sur des membranes en nylon selon le protocole du fabricant (Invitrogen, Burlington, ON). Les membranes ont été incubées avec un tampon de blocage (5 % de lait en poudre [p/v] et 0,05 % de Tween-20 dans du TBS) pendant 1 h à température ambiante. L'anti-lamine A/C de lapin (Cell Signaling Technology, Beverley, MA) a été utilisé à une dilution de 1:1000 et incubé avec la membrane pendant une nuit à 4oC. Les membranes ont été rincées trois fois avec un tampon de lavage (0,05 % de Tween-20 dans du TBS), puis incubées avec une dilution au 1/2000 de seconds anticorps conjugués à la peroxydase de raifort (âne anti-lapin, Amersham, Oakville, ON) pendant 1 h à la pièce Température. Après rinçage, les protéines sur les membranes ont été détectées à l'aide de substrats SuperSignal West Pico Chemiluminescent (Pierce, Rockord IL).

Analyse de co-immunoprécipitation avec l'émerine
Le kit de co-immunoprécipitation ProFound Mammalian (Pierce, Rockord IL) a été utilisé conformément aux instructions du fabricant. En bref, des lysats cellulaires pré-clarifiés provenant de cellules Hep-G2 transfectées ont été incubés pendant 2 h avec un gel de couplage d'anticorps anti-émerine (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) à température ambiante. Les protéines immunoprécipitées et les lysats entiers obtenus dans du tampon RIPA ont été soumis à un Western blot. La membrane a été sondée avec des anticorps spécifiques anti-émerine et anti-lamine A/C comme décrit (12).


Microscopie par immunofluorescence
L'ADNc de LMNA a été amplifié à l'aide des amorces 5'-CGG AAT TCA TGG AGA
CCC CGT CCC AG et 5'-CGG AAT TCT TAC ATG ATG CTG CAG TTC TG. Le fragment amplifié a été digéré puis cloné dans le cadre dans le vecteur pcDNA3.1/His avec une étiquette N-terminale codant pour l'épitope Xpress (Invitrogen, Burlington, ON). La fidélité de l'amplification et de l'insertion des ADNc témoins et mutants respectifs a été confirmée par analyse de la séquence d'ADN. Les cellules COS-7 ont été cultivées comme décrit ci-dessus. Les cellules transfectées ont été cultivées sur des lamelles en verre et ont été fixées dans du méthanol pendant 6 min à 10°C. Après les lavages avec du PBS, les cellules fixées ont été incubées avec un anticorps anti-Express-FITC à une dilution de 1:500 (Invitrogen, Burlington, ON), pendant 30 minutes à 37°C, lavées avec du PBS et montées sur des lames. L'efficacité de la transfection était d'environ 30 %. La microscopie par immunofluorescence a été réalisée comme décrit (13).

Analyses statistiques
Toutes les analyses statistiques ont été effectuées à l'aide de SAS v8.2 (Cary, NC), avec un P nominal <0,05.


RÉSULTATS

Anthropométrie et répartition des graisses
La taille, le poids et l'indice de masse corporelle du proposant 1 étaient de 165 cm, 60,2
kg et 22,1 kg/m2, respectivement et ceux du proband 2 étaient respectivement de 160,3 cm, 49,2 kg et 19,1 kg/m2. Le candidat 1 avait les mesures d'épaisseur de pli cutané suivantes : poitrine 8 mm, mi-axillaire 9 mm, sous-scapulaire 16 mm, supra-iliaque 11 mm, abdomen 14 mm, biceps 5 mm, triceps 6 mm, cuisse 7 mm et mollet 5 mm. Les mesures de circonférence étaient les suivantes : poitrine 93 cm, taille 73,5 cm (5-10e %ile pour l'âge et le sexe), hanche 87 cm, mi-bras 26,2 cm (15-25e %ile), mi-cuisse 41,2 cm (<5e %ile) et mollet 34 cm (15-25e %ile). Le candidat 2 avait les mesures d'épaisseur du pli cutané suivantes : poitrine 6 mm, mi-axillaire 6 mm, sous-scapulaire 12 mm, supra-iliaque 6 mm, abdomen 9 mm, biceps 3 mm, triceps 5 mm, cuisse 5 mm, mollet 4 mm. Les mesures de circonférence étaient la poitrine 84 cm, la taille 68,5 cm (<5%ile), la hanche 78,5 cm, le milieu du bras 22,2 cm (<5%ile), la cuisse 36,2 cm (<5%ile) et le mollet 30,5 cm (<5%ile ). Les mesures du pli cutané sont similaires à celles précédemment rapportées chez les personnes atteintes de FPLD2 (11), toutes les mesures se situant dans la plage inférieure (généralement <5 % ile) par rapport à la population normale, à l'exception de la mesure du pli cutané sous-scapulaire, qui était ~ 50e %ile de la normale pour Proband 1 et ~25e %ile pour Proband 2, respectivement. Proposition 1 aussi vait une mesure du pli cutané supra-iliaque qui se situait entre le 25e et le 50e centile. Les mesures de circonférence ont démontré des valeurs normales faibles. L'analyse d'impédance bioélectrique a indiqué 23,1 % de graisse corporelle, 76,9 % de masse maigre et 25,1 kg de masse musculaire squelettique pour Proband 1 et 17,8 % de graisse corporelle, 82,2 % de masse maigre et 23,7 kg de masse musculaire squelettique pour Proband 2. Il est à noter que ces sœurs ne présentaient aucune anomalie évidente de la masse musculaire. L'aspect clinique du Proband 1 est illustré à la figure 1.

Analyse de séquence d'ADN
Le proposant et sa soeur étaient chacun hétérozygotes pour un seul
changement de nucléotide dans leur ADN génomique, en particulier une nouvelle mutation G> C au niveau du site donneur d'épissage consensuel de l'intron 8 (figure 2A). La mutation était absente des génomes de 300 individus sains, dont 150 individus d'origine sud-asiatique.
La transcription inverse de l'ARNm des leucocytes des deux patients, suivie d'une électrophorèse sur gel, a montré que chacun avait deux espèces d'ADNc distinctes avec des tailles de fragment de 1121 et 1037 pb, par rapport à un seul fragment de 1037 pb transcrit à partir de l'ARNm des leucocytes d'un sujet témoin sain (Figure 2B ). La séquence de la bande mutante de 1121 pb a montré la rétention de l'intron 8 dans la séquence d'ARNm : le transcrit aberrant encodait 496 résidus de lamin A/C normaux, suivis de 20 nouveaux acides aminés et d'un codon d'arrêt prématuré (figure 2C).


Analyse Western et co-immunoprécipitation avec l'émerine
Les résultats de l'analyse Western des lysats de cellules HepG2 transfectées avec WT et l'ADNc de LMNA mutant du proband P1 et sondés avec un anticorps anti-lamine A sont présentés sur la figure 3A. La lamine A/C normale a été détectée dans tous les lysats cellulaires transfectés, mais l'isoforme tronquée de la lamine A n'a été détectée que dans le lysat des cellules qui ont été transfectées avec le LMNA mutant. Ainsi, la mutation de troncature pourrait être traduite et transcrite in vitro.


Les résultats de l'analyse Western des lysats de cellules HepG2 qui ont été co-immunoprécipités avec des anticorps d'émerine sont présentés sur la figure 3B. Le sondage de ces lysats de cellules entières avec un anticorps anti-lamine A a montré des bandes fortes à la position de la lamine A normale pour toutes les cellules transfectées, et une bande forte à la position de la lamine A mutante tronquée pour les cellules transfectées avec le LMNA mutant. Le sondage des lysats de cellules entières avec un anticorps anti-émérine a montré de fortes bandes à la position de l'émérine normale pour toutes les cellules transfectées. Après co-immunoprécipitation avec anti-émérine et buvardage, le sondage de lysats de cellules entières avec un anticorps anti-lamine A a montré des bandes à la position de la lamine A normale pour toutes les cellules transfectées, et la perte de la bande à la position de la lamine A mutante pour les cellules. transfecté avec le LMNA mutant, suggérant que la lamine A mutante avait perdu la capacité d'interagir avec l'émerine. Après co-immunoprécipitation avec l'anti-émérine et transfert, le sondage des lysats de cellules entières avec l'anticorps anti-émérine a montré des bandes à la position de l'émérine pour toutes les cellules transfectées. Ainsi, l'émérine co-précipite avec la lamine A normale mais pas avec l'isoforme tronquée.

Microscopie par immunofluorescence
Les noyaux immunocolorés des cellules transfectées avec l'ADNc de LMNA de type sauvage et mutant sont présentés à la figure 4. Lamin localisée spécifiquement autour de l'enveloppe nucléaire dans les cellules transfectées de type sauvage, mais a été localisée de manière diffuse dans le cytoplasme des cellules transfectées mutantes. De 70 cellules qui ont été transfectées avec WT LMNA, 19 avaient un signal de lamin A visible : dans 18 cellules (95 %) lamin A co-localisé avec le rebord nucléaire (figure 4A), avec la cellule restante montrant la présence du signal de lamin A dans le cytoplasme. À partir de 89 cellules qui ont été transfectées avec du LMNA mutant, 16 avaient un signal visible de lamin A : dans tous les 16 (100 %), le signal de lamin A a été observé dans le cytoplasme, sans co-localisation le long du bord nucléaire (figure 4B). Cette différence de proportion de cellules transfectées avec un LMNA de type sauvage par rapport à un mutant présentant une bordure nucléaire par rapport à une localisation cytoplasmique de l'anticorps anti-lamine était hautement significative (chi carré 2X2 = 31, 2, P <0, 00001).


DISCUSSION

Nous rapportons deux sœurs avec un phénotype FPLD2 sévère associé à une hétérozygotie pour un nouveau variant d'épissage LMNA. Une description clinique de leur mère suggérait qu'elle souffrait de la même maladie. Il s'agit de la première mutation d'épissage rapportée chez des patients FPLD2. La mutation codait pour une isoforme de lamine A qui était tronquée d'environ 30 %. La protéine mutante a été exprimée en quantités substantielles in vitro, ce qui suggère qu'elle n'est pas sujette à une dégradation ou à une dégradation à médiation non-sens. Des études de co-immunoprécipitation ont indiqué que la protéine mutante n'a pas interagi avec l'émerine. Contrairement à la lamine A normale, la protéine mutante n'a pas réussi à se localiser sur la membrane nucléaire et, à la place, était présente de manière diffuse dans tout le cytoplasme des cellules transfectées de manière transitoire. Les études in vitro indiquent que l'isoforme mutante est exprimée et a une fonction altérée, bien qu'il ne soit pas clair si le mécanisme pathogène in vivo chez les patients hétérozygotes est une déficience de la fonction normale ou le résultat d'une interférence avec le produit de l'allèle normal par le produit de l'allèle mutant.


Les caractéristiques les plus frappantes de la famille que nous rapportons sont l'âge précoce d'apparition et la gravité des caractéristiques typiques de FPLD2. L'apparition des caractéristiques cliniques dans FPLD2 se produit généralement à la puberté (10). Sur la base d'observations cliniques chez des patients FPLD2 présentant des mutations faux-sens LMNA R482Q et R482W, il a été supposé que l'événement déclencheur est la perte de tissu adipeux survenant tard dans l'enfance ou au début de la puberté. Il a été présumé que la résistance à l'insuline et les phénotypes biochimiques intermédiaires suivaient la perte de graisse. Cependant, il est intéressant de noter que le proposant 1 dans ce rapport présentait des stigmates de résistance à l'insuline, en particulier l'acanthosis nigricans, à l'âge de 5 ans, avec une ménarche précoce suivie d'un diagnostic de DT2 des années avant que la perte de graisse ne soit constatée cliniquement. Cette observation anecdotique suggère que la résistance à l'insuline pourrait précéder la perte de graisse cliniquement apparente, ce qui en fait temporairement la principale perturbation. La perte de graisse a traditionnellement été considérée comme l'événement déclencheur qui précède le développement de complications métaboliques dans le FPLD2, telles que la résistance à l'insuline (1,2). La capacité de génotyper les enfants dans les familles FPLD2, combinée à des marqueurs biochimiques plus sensibles et à des outils non invasifs pour détecter la perte de graisse peut aider e démêler l'ordre précis d'évolution des perturbations caractéristiques dans FPLD2.


D'autres caractéristiques cliniques chez nos patients qui soulignent la sévérité du phénotype FPLD2 associé à cette mutation d'épissage LMNA incluent l'âge précoce d'apparition de l'hypertension, le DT2 et l'hypertriglycéridémie sévère avec pancréatite secondaire, survenant à l'adolescence pour les deux proposants. De plus, nos patients présentent plusieurs caractéristiques non rapportées auparavant dans FPLD2. Le candidat 1 avait une hidrosadénite suppurée, une infection acnéiforme des glandes apocrines cutanées qui peut également impliquer le tissu sous-cutané et le fascia adjacents. Le candidat 2 a eu deux occurrences de paralysie du sixième nerf. Bien que la dépression ait été rapportée chez au moins un autre patient (11), nos patients ont été diagnostiqués pendant l'enfance et le proposant 1 a nécessité de nombreuses hospitalisations au cours de son adolescence. Ils continuent d'être suivis et traités.


Il y a une certaine suggestion d'implication chevauchante d'autres systèmes d'organes, tels que les systèmes cardiaques et neurologiques, associés à cette mutation chez les proposants et leur mère. Cependant, les occurrences de paralysies du sixième nerf crânien chez le proposant 2 n'ont pas été signalées dans FPLD2 en raison d'autres mutations LMNA. De même, la possibilité d'une cardiomyopathie chez la mère des proposants a été suggérée par une fibrillation auriculaire diagnostiquée à 25 ans et un diagnostic de cardiomyopathie non spécifique nécessitant la mise en place d'un stimulateur cardiaque. Un autre patient FPLD2 avec la mutation LMNA R62G avait une cardiomyopathie et des défauts de conduction en plus des caractéristiques typiques de FPLD (11). D'autres patients avaient des signes cardiaques et lipodystrophiques associés au LMNA R527P et Mutation R60G (12). Un patient porteur de la mutation LMNA R133L avait une cardiomyopathie hypertrophique avec atteinte valvulaire (13). La faiblesse musculaire précédemment signalée chez les patients atteints de FPLD2 a tendance à être proximale et plusieurs présentent une faiblesse importante des ceintures des membres. Le candidat 2 avait une faiblesse musculaire, mais n'avait pas d'élévation de la créatine kinase sérique qui a été rapportée précédemment (14,15). Un patient porteur de la mutation faux-sens LMNA R482W avait une dystrophie sévère des muscles des ceintures avec perte de la marche, en plus de FPLD2 (14). Récemment, un patient atteint d'arthropathie, de calcinose tendineuse et de progeria s'est avéré porteur d'une mutation homozygote faux-sens LMNA S573L (16).



En résumé, nous rapportons la première mutation d'épissage LMNA dans FPLD2, qui était associée à un phénotype sévère et à une fonction in vitro altérée, y compris l'incapacité d'interagir avec l'émerine et l'incapacité de se localiser au niveau de l'enveloppe nucléaire. En général, la position de la mutation au sein du gène LMNA détermine le type et l'étendue de l'atteinte tissulaire (3), en particulier pour les mutations faux-sens. Cependant, cette mutation unique pourrait servir de «sonde» naturelle dans de futures études in vitro et in vivo conçues pour comprendre la pathogenèse et les conséquences phénotypiques de la fonction d'enveloppe nucléaire perturbée dans la maladie humaine.



REMERCIEMENTS

Drs. Celia Rodd et Natasha Garfield ont initialement référé le patient à notre clinique. Le Dr Morel est actuellement boursier en génétique métabolique à l'Hôpital pour enfants malades de Toronto, Ontario, Canada. Nous remercions Jay McFarlan pour l'assistance technique avec des expériences. Nous remercions la Dre Stéphanie Chevalier du Centre des sciences de la nutrition et des aliments de McGill pour avoir effectué les mesures anthropométriques et l'analyse d'impédance bioélectrique.